杭州奧盛Feyond-A500多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行Transcreener熒光偏振測定

Transcreener技術(shù)是一種基于核苷酸檢測的通用高通量生化檢測平臺。該測定法是基于二磷酸核苷酸(ADP/GDP) 的檢測，二磷酸核苷酸可由數(shù)千種激酶催化而形成，其中許多酶催化共價調(diào)節(jié)反應(yīng)，這些反應(yīng)是細(xì)胞信號傳導(dǎo)的核心，在藥物發(fā)現(xiàn)中具有重要價值。

2024-09-03 17:03:07南京辰雨凡麗商貿(mào)有限公司57

原理

所有測定的試劑是與高特異性單克隆/多克隆抗體結(jié)合的遠(yuǎn)紅外示蹤劑。酶反應(yīng)產(chǎn)生二磷酸核苷酸或單磷酸核苷酸，將抗體-淬滅劑偶聯(lián)物中的示蹤劑置換下來。由于示蹤劑的旋轉(zhuǎn)自由度增加，導(dǎo)致極化降低。

驗證標(biāo)準(zhǔn)

配制10μM ATP/ADP標(biāo)準(zhǔn)曲線，以這類標(biāo)準(zhǔn)曲線模擬酶反應(yīng)。從10μM ATP開始，ADP的添加量增加，ATP按比例減少，總腺嘌呤核苷酸濃度保持在10μM。需要在10μM ATP轉(zhuǎn)化率為10%時，Z’>0.7和ΔmP>120。

材料與方法

·Feyond-A500多功能酶標(biāo)儀（杭州奧盛）

·Transcreener? ADP2 FP Assay（貨號：3010-1K）

·緩沖溶液中的 ATP/ADP 混合物( 恒定的腺嘌呤濃度10μM )

·Corning全黑酶標(biāo)板96孔板熒光檢測板（貨號：3915）

表1 ADP/ATP標(biāo)曲配制（10μM母液）

% 濃度	ATP	ADP
100	0	100
75	25	75
50	50	50
25	75	25
15	85	15
10	90	10
7.5	92.5	7.5
5	95	5
3	97	3
2	98	2
1	99	1
0	100	0

表2 儀器參數(shù)設(shè)置

模式	熒光偏振
激發(fā)波長 EX	624-40 nm
發(fā)射波長 EM	692-40 nm
G-factor	1.06
次數(shù)	150
增益	自動增益
積分時間	40 μs

1.FP測量模式選擇

2.儀器參數(shù)設(shè)置

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結(jié) 果

隨著ADP：ATP比例增加，結(jié)合示蹤劑與游離示蹤劑的比例降低，導(dǎo)致mP值整體下降。在Feyond-A500酶標(biāo)儀上讀取標(biāo)品點。

A：在模擬10μM ATP轉(zhuǎn)化為ADP的標(biāo)準(zhǔn)曲線中觀察到的Z'和ΔmP值。

B：標(biāo)準(zhǔn)曲線0-2.5μM ADP部分放大圖顯示，Z'驗證最小合格數(shù)據(jù)(藍(lán)色虛線)和ΔmP驗證最小合格數(shù)據(jù)(紅色虛線)。10% ATP轉(zhuǎn)換驗證點(垂直黑色虛線)。

結(jié) 論

Feyond-A500多功能酶標(biāo)儀通過了Transcreener ADP² FP測定的驗證標(biāo)準(zhǔn)。基于濾光片的測量結(jié)果Z’值為0.79（標(biāo)準(zhǔn)：在10 μM ATP下10%轉(zhuǎn)化率時Z’值>0.70），ΔmP的測量結(jié)果為140（標(biāo)準(zhǔn)：在10 μM ATP下10%轉(zhuǎn)化率時ΔmP>120 mP）。