Auto-NGS 200是一款高通量、功能豐富、配置靈活的桌面型多功能自動(dòng)化移液工作站。該工作站由熒光計(jì)、機(jī)械工作臂、溫度控制、PCR儀等功能模塊及一臺(tái)計(jì)算機(jī)構(gòu)成，可通過(guò)編寫程序控制工作站運(yùn)行，模擬人工操作流程進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。該工作站每批次可構(gòu)建96個(gè)文庫(kù)。除實(shí)驗(yàn)過(guò)程中涉及的試劑配制需要人工進(jìn)行以外，其余步驟均可在Auto- NGS 200中自動(dòng)完成。

● Auto-NGS 200基因測(cè)序文庫(kù)制備工作站

● A公司tNGS試劑

● Qubit1X dsDNA HS Assay Kit試劑

● 主要耗材

96孔PCR 板、PCR 密封蓋、96方孔圓底1.0mL 板、200μL自動(dòng)化吸頭、96道儲(chǔ)液槽、八連PCR管(0.2mL)、100mL儲(chǔ)液槽、96孔儲(chǔ)液槽等。

a. 線性測(cè)試：?jiǎn)我话袠?biāo)(甲流培養(yǎng)物)核酸提取后稀釋10倍(高濃度)；稀釋100倍 (中濃度)；1000倍(低濃度)測(cè)試病原檢出數(shù)。手工，自動(dòng)化同步測(cè)試，對(duì)比兩種方法的檢出差異。

b.檢出限測(cè)試：以試劑盒檢出限為參照，對(duì)低濃度樣本進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建后上機(jī)測(cè)序。

c. 污染測(cè)試：將樣本和NTC以梅花樁模式在耗材中排版，通過(guò)測(cè)序結(jié)果判定實(shí)驗(yàn)污染情況。

將甲流培養(yǎng)物核酸提取后稀釋10倍（高濃度）；稀釋100倍（中濃度）；1000倍（低濃度），按照?qǐng)D3的形式將不同濃度的核酸轉(zhuǎn)移到PCR板中。手工文庫(kù)構(gòu)建同理，對(duì)比檢出差異。

根據(jù)試劑盒說(shuō)明書建立工作站運(yùn)行程序，文庫(kù)產(chǎn)出后在Auto-NGS 200內(nèi)置熒光計(jì)檢測(cè)濃度，如圖2所示，NGS-200文庫(kù)濃度略高于手工建庫(kù)，自動(dòng)化建庫(kù)的CV(變異系數(shù))與手工建庫(kù)無(wú)顯著差異(P<0.05)。

圖 2 文庫(kù)濃度

將文庫(kù)產(chǎn)物隨機(jī)選取4個(gè)樣本在Agilent 4150 TapeStation系統(tǒng)進(jìn)行文庫(kù)片段分析，并與人工建庫(kù)產(chǎn)物進(jìn)行對(duì)比。片段結(jié)果如圖3所示，片段長(zhǎng)度和平均片段大小均與人工建庫(kù)結(jié)果相似。

圖 3 文庫(kù)片段長(zhǎng)度

構(gòu)建成功的文庫(kù)在Auto-NGS 200中，以96混1的方式進(jìn)行Pooling，每個(gè)樣本質(zhì)量為60ng進(jìn)行均一化處理后做測(cè)序前準(zhǔn)備。在MiniSeq System平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如圖4所示。

圖 4 Auto-NGS 200 建庫(kù)和手工建庫(kù)歸一化reads 數(shù)分布圖

如表2，實(shí)驗(yàn)方案：選擇DNA 病毒，RNA 病毒，細(xì)菌，真菌各兩種，共8例樣本；將同一樣本同一濃度的核酸混為一管；根據(jù)核酸量分裝，每孔14μL。使用手動(dòng)-自動(dòng)化建庫(kù)對(duì)檢測(cè)限核酸進(jìn)行建庫(kù)，比較兩種方法的檢出差異。

按照表2的形式將DNA 病毒1(4000)、RNA 病毒1(1000)、DNA 病毒2 (2000)、RNA 病毒2(500)、真菌1(10000)、細(xì)菌1(10000)、真菌2(10000)、細(xì)菌2(15000)培養(yǎng)物的核酸產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到PCR 板中。手工文庫(kù)構(gòu)建同理，對(duì)比測(cè)序結(jié)果能否檢出。

表 2 Auto-NGS 200 文庫(kù)構(gòu)建核酸排版

文庫(kù)濃度檢測(cè)方法同3.1.1，如圖5所示，Auto-NGS 200文庫(kù)濃度略高于手工建庫(kù)。

如表3所示，自動(dòng)化建庫(kù)與手工建庫(kù)檢出結(jié)果。

如圖6所示，將樣本和NTC以梅花樁形式在96孔PCR板中排版，通過(guò)NTC的歸一化reads值判定實(shí)驗(yàn)污染情況。手工和儀器同步。

圖 6 污染情況

根據(jù)線性測(cè)試測(cè)序數(shù)據(jù)來(lái)看，最終的歸一化reads值對(duì)應(yīng)樣本濃度的梯度。Auto-NGS 200 文庫(kù)濃度略高于手工建庫(kù)，自動(dòng)化建庫(kù)的CV (變異系數(shù))與手工建庫(kù)無(wú)顯著差異。Auto-NGS 200 的甲流歸一化reads 值約為手工建庫(kù)的80~85%;儀器建庫(kù)濃度較手工濃度略高，尤其是稀釋梯度為10時(shí)較明顯；手工建庫(kù)重復(fù)性不如儀器建庫(kù)，變異系數(shù)(CV) 較大。

根據(jù)上機(jī)信息表給出的培養(yǎng)物種類，認(rèn)為歸一化reads值≥20即為檢出，結(jié)果如表1所示。DNA 病毒2自動(dòng)建庫(kù)有漏檢，RNA 病毒2均有漏檢。其余病原檢出情況：本次實(shí)驗(yàn)存在一定污染，樣本檢出不止有培養(yǎng)物目標(biāo)病原，根據(jù)病原檢出頻譜分析，將部分頻譜一致的病原也納入統(tǒng)計(jì)，主要有鼻病毒、乙流、洋蔥伯克霍爾德菌復(fù)合群等污染。

自動(dòng)化建庫(kù)的整體污染同手動(dòng)建庫(kù)相差不大，自動(dòng)化建庫(kù)主要是白念、洋蔥等病原污染，手動(dòng)建庫(kù)主要是鼻病毒、非結(jié)核分枝桿菌等污染。從排版看手動(dòng)NTC基本無(wú)甲流污染，自動(dòng)NTC基本無(wú)甲流污染。

NTC檢出頻譜：鼻病毒、大腸埃希菌、白念珠菌檢出頻次最高，且在排版上分布較廣，懷疑可能實(shí)驗(yàn)室環(huán)境有這幾種病原污染；手動(dòng)建庫(kù)鼻病毒、流感嗜血桿菌、具核梭桿菌污染明顯升高。